我們的體外轉(zhuǎn)錄載體是簡單有效的RNA轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，適用于各種研究。小RNA體外轉(zhuǎn)錄載體產(chǎn)生的小RNA，適用于生化研究、shRNA敲除或CRISPR/gRNA介導(dǎo)的基因編輯等細(xì)胞或胚胎注射，以及需要特定短RNA序列的其他應(yīng)用。

該系統(tǒng)利用目的序列上游的T7啟動子，通過T7噬菌體RNA聚合酶（T7 RNAP）和三磷酸核苷酸，在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件下高效生成小RNA。我們建議您參考已發(fā)表文獻(xiàn)中經(jīng)測試的體外轉(zhuǎn)錄步驟說明來進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。

T7 RNAP對于有效的轉(zhuǎn)錄起始具有堿基要求，且這些堿基已經(jīng)被放置到載體上。T7啟動子3'末端的前兩個堿基是GG，緊接著是客戶的目的序列。

我們的小RNA體外轉(zhuǎn)錄載體會發(fā)生失控轉(zhuǎn)錄，這意味著T7 RNAP的轉(zhuǎn)錄能進(jìn)行到DNA模板的末端，不會在質(zhì)粒內(nèi)的任何特定位點(diǎn)終止。因此，在體外轉(zhuǎn)錄之前，應(yīng)通過使用SapI來單酶切線性化環(huán)狀質(zhì)粒。SapI單酶切位點(diǎn)正好位于目的序列的下游。值得注意的是，待轉(zhuǎn)錄的序列不能含有所用線性化酶切位點(diǎn)，以免產(chǎn)生截短的mRNA。不純的酶切產(chǎn)物可能會抑制隨后的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，因此建議通過柱子或酚氯仿來純化酶切產(chǎn)物。

在體內(nèi)應(yīng)用中，許多RNA都會進(jìn)行5'末端的修飾，稱為5'加帽。對于不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，未加帽的體外轉(zhuǎn)錄小RNA通常能產(chǎn)生良好的實(shí)驗(yàn)效果。請根據(jù)您的實(shí)驗(yàn)性質(zhì)來決定RNA是否需要加帽。 如果需要，則可以通過使用帽子類似物共轉(zhuǎn)錄或使用加帽酶轉(zhuǎn)錄后修飾獲得加帽RNA。

關(guān)于該載體系統(tǒng)的更多信息，請參考以下文獻(xiàn)。

我們的小RNA體外轉(zhuǎn)錄載體能高效用于T7 RNAP介導(dǎo)的體外轉(zhuǎn)錄。該載體在大腸桿菌中具有高拷貝復(fù)制能力，易于酶切，有助于大量生成小RNA。

效率高：T7 RNAP是高效酶，其介導(dǎo)的體外轉(zhuǎn)錄可大量產(chǎn)生功能性RNA。

技術(shù)簡單：操作簡便，比在細(xì)胞中表達(dá)mRNA容易，且在細(xì)胞中表達(dá)mRNA還需要進(jìn)行轉(zhuǎn)染和細(xì)胞培養(yǎng)。

方向特定：該載體系統(tǒng)只含有單個體外轉(zhuǎn)錄啟動子，如需要有義和反義轉(zhuǎn)錄物，則需要兩個載體。

失控轉(zhuǎn)錄：為了產(chǎn)生正確有效的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，在進(jìn)行轉(zhuǎn)錄反應(yīng)之前需要通過限制性內(nèi)切酶線性化質(zhì)粒模板。

T7 promoter: A promoter for the RNA polymerase from T7 bacteriophage. Drives high-level transcription of the downstream sequence of interest.

Transcribed sequence: Your chosen DNA sequence of interest to be transcribed into RNA is placed here.

SapI: Unique restriction endonuclease site that can be used to linearize the plasmid prior to in vitro transcription.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.